導讀：近日，貝瑞基因與廣西柳州市婦幼保健院合作的地中海貧血基因圖譜項目研究成果發(fā)表于國際權威期刊《Journal of Human Genetics》，文章題目為《The value of single-molecule real-time technology in the diagnosis of rare thalassemia variants and analysis of phenotype–genotype correlation》。研究通過對比三*測序單分子實時測序技術(SMRT)和傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合[(Gap-PCR，多重連接探針擴增技術(MLPA)，PCR-反向斑點雜交(RDB)]對地中海貧血基因變異的檢出率，分析地貧基因變異的分子特征和表型，探索SMRT技術在地貧篩查中的臨床應用優(yōu)勢。

　　該研究入組185名男性和249名女性，年齡范圍為3天至56歲，平均年齡為26.4±12.59歲。

　　入選患者應至少符合以下一項入選標準：

　　（1）血常規(guī)檢查顯示MCV≤80fl和/或MCH≤27pg；

　　（2）血紅蛋白電泳顯示HbA2<2.5%或HbA2≥3.5%或HbF升高或血紅蛋白異常；

　?。?）常規(guī)遺傳學診斷結果與血液學表型結果不一致；

　?。?）患者生下中度或重度地中海貧血患兒；

　?。?）可能存在超出常規(guī)基因檢測技術范圍的異常情況。

　　（1）基本臨床資料不完整；

　?。?）患者有其他血液疾病；

　　（3）患者有精神異?；蛘J知功能障礙。

　　該研究應用三*地貧技術（SMRT）與傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合（一線方法PCR-RDB/Gap-PCR+二線方法MLPA等）進行背靠背對比。

　　在434例入組樣本中，使用傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合(Gap-PCR和/或MLPA，RDB)，共檢出318例樣本存在地貧基因變異(73.27%)，116例樣本無變異(26.73%)。SMRT技術“一次到位”鑒定出361例樣本存在地貧基因變異(83.18%)，73例樣本無變異(16.82%)。相比傳統(tǒng)方法，SMRT對434例血液學初篩陽性或地貧表型明確的樣本的基因診斷陽性檢出率提高9.91%。

　　圖1：傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合與三*地貧技術（SMRT）檢測結果分析

　　結合兩種技術分析，研究共檢出49種變異類型及485條陽性等位基因。其中，SMRT檢出47種變異類型(95.92%)及482個地貧基因變異(99.38%)，與傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合相比，僅三*SMRT技術可以檢出的基因變異型別多達30種占比61.23%（30/49），僅三*SMRT技術可以檢出的陽性等位基因多達77條占比15.88%（77/485）。

　　圖2：49種變異類型及485條陽性等位基因分布圖

　　*圖A黃色部分：僅三*SMRT技術可以檢出的基因變異型；圖B淺綠色部分：僅三*SMRT技術可以檢出的陽性等位基因

　　備注：上述研究結論中提及三*測序SMRT技術未檢測到的HS40和HBG基因上兩個位點不在該研究開展時三*的設計檢測范圍內，現(xiàn)有三*測序SMRT技術已迭*升級在技術上全面覆蓋，可滿足不同臨床需求。

　　結果三：多種常規(guī)基因診斷技術聯(lián)合應用，仍存在高比例誤診

　　通過研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合將2例HKαα/αα基因型的樣本，誤診為-α3.7/αα基因型，誤診率高達4.17%(2/48)，而SMRT技術鑒定結果100%準確。

　　此外，SMRT技術經(jīng)基因組可視工具IGV直觀顯示，樣本編號為D141966樣本基因型“一目了然”可判讀為-α3.7/αα，而常規(guī)方法（Gap-PCR）檢測的結果為-α3.7/-α3.7，最終經(jīng)MLPA技術驗證，SMRT結果100%正確。研究者通過SMRT數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)原因：HBA2基因3’-末端傳統(tǒng)Gap-PCR引物設計區(qū)域存在3個SNV/indels位點，因PCR擴增時等位基因脫扣導致-α3.7等位基因漏診。

　　圖3：D141966樣本三種技術基因分型結果

　　*圖A：Gap-PCR檢測結果為-α3.7/-α3.7；圖B：SMRT檢測結果為-α3.7/αα；圖C：經(jīng)MLPA測定樣本基因型為-α3.7/αα、紅框區(qū)域表示-α3.7缺失位置

　　在研究中，SMRT可檢出更多種基因型，包括罕見α-珠蛋白基因缺失、α三聯(lián)體（或多拷貝數(shù)變異）等，以上變異均不在傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合檢測覆蓋范圍內。其中，-SEA/-α2.4基因型患者在臨床上表現(xiàn)為HbH病；攜帶αααanti3.7和αααanti4.2基因型變異的受檢者雖然血液學表型正常，但當與β-地中海貧血復合時，由于α鏈和β鏈之間的不平衡加劇，可表現(xiàn)為中重型β-地中海貧血，HbF也顯著增加。因此，由于傳統(tǒng)地貧基因檢測方法存在局限性，極有可能導致高風險人群型地貧漏診，存在生育中重型地貧患兒的風險。

　　圖4：α-珠蛋白基因缺失、α三聯(lián)體基因型樣本血常規(guī)及血紅蛋白電泳檢測結果

　　通過基因組可視化工具IGV圖展示可看到，SMRT技術對野生型等位基因和變異等位基因（包括結構變異(SV)、單核苷酸變異(SNVs)等）可進行非常直觀高效的判讀，有助于研究者在單分子水平上增加對地貧變異的理解，為地貧基因變異與臨床表型分析提供重要線索。

　　圖5：地貧基因變異IGV圖

　　*圖A：地貧HBA1/2基因中的結構變異(SV)；圖B：地貧HBA1、HBB基因中的單核苷酸變異(SNVs)；圖C：-α2.4缺失型IGV圖

　　與傳統(tǒng)地貧基因檢測方法組合應用相比，“一次到位”的三*測序SMRT技術具有檢測范圍更廣、準確性更高、費效比更優(yōu)等優(yōu)點，可更好地豐富各地區(qū)地中海貧血基因變異及異常血紅蛋白變異圖譜，大大減輕臨床地貧診斷的壓力，為地貧出生缺陷防控提供強有力的支持。