Frontiers in Endocrinology.November 2021;12:774997

　　實(shí)驗(yàn)性研究

　　1.收集胎盤組織：收集IVF-ET妊娠（n=3）和自然妊娠（n=3）后行剖宮產(chǎn)分娩的胎盤組織樣本。并收集8例IVF-ET妊娠和8例自然妊娠來源的胎盤組織作為驗(yàn)證隊(duì)列。盡可能的在整個(gè)胎盤中部選取組織，以最大限度地減少其他部分對(duì)基因表達(dá)的影響。所有胎盤組織用預(yù)冷的PBS沖洗，并保存在-80°C，直到隨后提取RNA。組織采集經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者在采集樣本前均征得書面知情同意。

　　2.納入標(biāo)準(zhǔn)：①納入標(biāo)準(zhǔn)：IVF-ET妊娠后單胎足月分娩；37~42孕周；嬰兒出生體重2500~4000 g；年齡20~35歲，無任何妊娠并發(fā)癥；②選擇與之嚴(yán)格匹配的自然妊娠產(chǎn)婦作為對(duì)照組，匹配參數(shù)包括：產(chǎn)婦的年齡、產(chǎn)次、孕周和胎兒性別等。

　　3.RNA的提取和測序：分離RNA、驗(yàn)證RNA濃度和完整性，然后對(duì)樣品進(jìn)行文庫準(zhǔn)備和測序。每個(gè)樣本的測序讀段至少為10M，質(zhì)量大于20的堿基比例大于95%，質(zhì)量控制符合數(shù)據(jù)分析的要求。

　　4.差異表達(dá)分析：利用R 3.5.2的DESeq2包分析差異表達(dá)的miRNAs(DEmiRs)和基因(DEGs)，并使用貝葉斯方法來校正批次效應(yīng)。以變化倍數(shù)>1.5和P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)的miRNAs和mRNAs。

　　5.轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)的GO富集分析：DEmiRs被上傳到FunRich軟件，用于篩選上游轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄因子途徑的增強(qiáng)靶標(biāo)，并進(jìn)行GO富集分析。

　　6.MiRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建:使用miRWalk V2.0、StarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測DEmiRs的靶基因。隨后，將預(yù)測的靶基因與DEGs進(jìn)行匹配，并利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

　　7.GO和KEGG富集物分析:對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并使用R Studio中的ggplot2包來識(shí)別與DEGs相關(guān)的顯著改變的生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CCS)、分子功能(MF)和相關(guān)信號(hào)通路等。

　　8.蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵基因識(shí)別:將差異表達(dá)的基因上傳到STRING數(shù)據(jù)庫。綜合得分>0.4的交互作用被認(rèn)為是顯著的。PPI網(wǎng)絡(luò)中的目的基因作為節(jié)點(diǎn)，來自兩個(gè)節(jié)點(diǎn)的線表示相關(guān)的交互作用。用Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。用Cytosscape的CytoHubba插件篩選出與其他基因關(guān)聯(lián)度最高的前10個(gè)基因作為關(guān)鍵基因。

　　9.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）:使用ReverTra Ace qPCR RT Kit將1 mg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用特異性引物合成miRNAs的cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，將結(jié)果歸一化到U6，并用2-??CT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的變化。

　　(1)體外受精-胚胎移植胎盤差異表達(dá)基因的鑒定：總共鑒定了12個(gè)差異表達(dá)的miRNAs包括4個(gè)下調(diào)的miRNAs：hsa-miR-1269a、hsa-miR204-5p、hsa-miR-224-5p和hsa-miR-941，以及8個(gè)上調(diào)的miRNAs：hsa-miR-1269b、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-193B-3p、hsa-miR-193B-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-371a-5p、hsa-miR4286和hsa-miR-9-5p。還鑒定了258個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，其中52個(gè)下調(diào)，206個(gè)上調(diào)。

　　(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測胎盤組織中的DEmiRs：與對(duì)照組相比，IVF-ET組hsa-miR-204-5p、hsa-miR-1269a和hsa-miR-941的相對(duì)表達(dá)水平顯著下調(diào)，而hsa-miR-4286、hsa-miR-31-5p和hsa-miR-125b-5p的相對(duì)表達(dá)水平分別上調(diào)。結(jié)果表明，這些miRNAs的表達(dá)失調(diào)發(fā)生在IVF-ET來源的胎盤組織中，但需要進(jìn)一步的驗(yàn)證才能支持測序數(shù)據(jù)和研究分析的準(zhǔn)確性。

　　(3)轉(zhuǎn)錄因子和GO富集分析:確定了SP1、EGR1、SP4、KLF7、ONECUT 1、MYF5、TCF3、NFIC、SRF和HOXB4與DEmiRs之間存在相互調(diào)控作用。SP1能夠調(diào)節(jié)大多數(shù)DEmiRs。GO富集分析表明，DEmiRs的前5位生物學(xué)過程涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核苷酸堿基、核苷酸和核酸*謝的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。大多數(shù)基因涉及轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、RNA結(jié)合、受體信號(hào)復(fù)合支架活性和GTPase活性。前5位富集的細(xì)胞成分是細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、高爾基體、溶酶體和膜筏等。

　　(4)miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：該網(wǎng)絡(luò)中共有109個(gè)DEGs與12個(gè)的DEmiRs相互作用。其中下調(diào)的DEmiRs，特別是hsa-miR-204-5p、hsa-miR1269a和hsa-miR-941，形成了最廣泛的靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，而上調(diào)的DEmiRs具有更離散的靶基因。

　　(5)DEGs的功能富集分析：結(jié)果發(fā)現(xiàn)與血管生成、妊娠、細(xì)胞黏附、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控以及血管生成的正調(diào)控相關(guān)的生物學(xué)過程顯著富集。此外，蛋白質(zhì)結(jié)合、poly(A)RNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活劑活性占分子功能的大部分，而最豐富的細(xì)胞學(xué)組分是細(xì)胞外泌體、膜和胞外區(qū)域等。KEGG顯著富集的通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路、RAS信號(hào)通路以及細(xì)胞黏附等。

　　(6)蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：使用在線STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape中的工具構(gòu)建了一個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)，評(píng)估了它們的連接度，并確定了10個(gè)關(guān)鍵基因。

　　(7)關(guān)鍵基因的生物學(xué)分析：使用Cytoscape的cytoHubba插件揭示了IVF-ET中DEGs之間最密切相關(guān)的十個(gè)基因相互作用。最有可能的關(guān)鍵基因包括EGFR,FOS,SERPINE1,LEP,HGF,EGR1,SPP1,HNRNPA2B1,IGF2和ENG，這10個(gè)基因的KEGG富集分析顯示，MAPK信號(hào)通路以及PI3K-Akt信號(hào)通路被顯著富集。

　　(1)本研究發(fā)現(xiàn)，與自然妊娠胎盤組織相比，IVF-ET妊娠胎盤組織中共有12個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。其中，hsa-miR-204-5p、hsamiR-1269a和hsa-miR-941被證實(shí)在IVF-ET胎盤組織中特異性下調(diào)。盡管潛在的機(jī)制仍不清楚，但有研究表明這三個(gè)miRNAs都與胎盤功能障礙和胎兒生長相關(guān)。

　　(2)排名最靠前的轉(zhuǎn)錄因子是特異性蛋白1(SP1)，它是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，與多種富含GC的基序結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)和功能與胚胎發(fā)育和分化相關(guān)的基因的表達(dá)。

　　(3)我們的研究發(fā)現(xiàn)了10個(gè)關(guān)鍵基因，大多與胎盤發(fā)育和胎兒生長相關(guān)。

　　(4)在miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，下調(diào)的DeMiRs具有更廣泛的靶基因，特別是miR-204-5p，miR-1269a和miR-941，且這些基因參與調(diào)節(jié)胎盤功能。該網(wǎng)絡(luò)有助于研究這些靶基因是如何受到miRNA的調(diào)控而發(fā)生表達(dá)改變的。DeMiRs對(duì)靶基因的調(diào)控及對(duì)胎盤功能的影響，我們會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

　　(5)由于驗(yàn)證時(shí)的所選取樣本量相對(duì)較少，可能會(huì)降低研究結(jié)果的可靠性。此外，生物信息學(xué)分析提出的分子相互作用和功能關(guān)系，需要在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。

　　我們的數(shù)據(jù)揭示了先前發(fā)現(xiàn)的與胎盤功能障礙和妊娠并發(fā)癥相關(guān)的miRNAs和mRNAs以及新的候選基因。這些數(shù)據(jù)為后續(xù)研究IVF-ET對(duì)胎盤發(fā)育和功能的影響提供了現(xiàn)成的資源，并可能為今后預(yù)防和改善不良圍產(chǎn)期結(jié)局提供基礎(chǔ)。