Front Cell Dev Biol.2021;9:647130

　　實驗性研究

　　1.研究人群：來自蘇州市立醫(yī)院、鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九醫(yī)院輔助生殖科的465例*母細胞成熟阻滯、受精失敗或早期胚胎發(fā)育停滯的不孕女性，取外周血樣本提取DNA。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會和各醫(yī)院倫理委員會批準。

　　(1)女性年齡＜45歲，性生活正常，未避孕1年(或更長時間)未能獲得妊娠；

　　(2)≥2次IVF/ICSI助孕失敗史，失敗原因以*母細胞成熟阻滯、受精失敗或早期胚胎停滯為特征。

　　排除標準：有男性因素、染色體異常、放療或化療等其他已知不孕癥原因的女性。

　　2.基因測序及篩選：用QIAamp DNA血液微量試劑盒(QIGEN)從外周血中提取基因組DNA。使用SeqCap EZ Exome Kit(Roche)進行全外顯子組捕獲，并在Illumina NovaSeq 6000平臺(Illumina)上進行測序，測序分析與人類參考序列(NCBI Genome Build GRCh37)進行比較。突變用GRCh37和dbSNP（版本138）和基因組聚合數(shù)據(jù)庫(gnomAD)數(shù)據(jù)庫以及我們的內(nèi)部外顯子組數(shù)據(jù)庫進行注釋，并用SIFT和MutationTaster程序進行功能預(yù)測(預(yù)測結(jié)果：T=耐受，D=損傷或致病，NA=不可用)。對來自血親家庭的患者，進行純合子定位。所有候選突變按照標準進行篩選，對受影響的先證者及其父母和兄弟姐妹進行Sanger測序確認。

　　3.TA克隆構(gòu)建：從家系3的先證者基因組中擴增出復(fù)合雜合突變序列(c.1155G>C和c.330+1G>A)，并將其克隆到pClone007載體中。

　　4.表達載體的構(gòu)建：從人類MI期*母細胞cDNA中擴增出野生型CDC20全長編碼序列(GenBank：NM_001255.3)，并將其克隆到pCMV6空載體中。使用KOD-Plus誘變試劑盒(Toyobo)誘發(fā)點突變。將FLAG標簽插入野生型和突變型載體的c端用于定位實驗。

　　5.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：中國倉鼠*巢(CHO)細胞使用添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的改良EAGLE培養(yǎng)液(Gibco)，放置于37?C，5%CO2的濕式培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。使用PolyJet體外DNA轉(zhuǎn)染試劑(SignaGen)將CDC20野生型和突變型載體轉(zhuǎn)染到CHO細胞中。

　　6.蛋白質(zhì)印跡法：轉(zhuǎn)染前1天將CHO細胞接種在六孔板中，然后轉(zhuǎn)染1μg質(zhì)粒。使用含有1%蛋白酶抑制劑混合物(Bimake)的RIPA裂解緩沖液(上海威奧生物)裂解細胞。蛋白質(zhì)濃度通過BCA方法測定，等量的蛋白質(zhì)在10%SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉1小時，并與一抗在4℃孵育過夜。抗CDC20(14866，CST)和細胞周期蛋白B1(55004-1AP，Proteintech)抗體1:1000稀釋使用，抗紐蛋白抗體1:3000稀釋(13901，CST)使用作為內(nèi)參。用山羊抗兔IgG(1:5000稀釋，M21001，Abmart)作為二抗檢測一抗。與二抗(1:5000稀釋，Abmart)孵育后，使用ECL蛋白質(zhì)印跡底物(Tanon)最終獲得蛋白印跡。

　　1.臨床特征：三名先證者盡管月經(jīng)周期正常，但均被診斷為原因不明的原發(fā)性不孕癥，其伴侶的精子計數(shù)、精子形態(tài)和活力均正常。IVF/ICSI助孕周期反復(fù)出現(xiàn)*母細胞成熟阻滯，受精失敗及早期胚胎發(fā)育停滯等。

　　2.CDC20新突變的鑒定：對納入人群的測序進行CDC20(GenBank：NM_001255.3)的突變篩選，確定了來自3個獨立家系的4個CDC20純合和復(fù)合雜合突變的受累個體。

　　(1)家系1：純合子錯義突變c.887G>A(p.Arg296Gln)(SIFT及MutTa預(yù)測結(jié)果D)；

　　(2)家系2：復(fù)合雜合突變，包括錯義突變c.965G>a(p.Arg322Gln)(SIFT預(yù)測結(jié)果T，MutTa預(yù)測結(jié)果D)和無義突變c.964C>T(p.Arg322*)(SIFT預(yù)測結(jié)果NA，MutTa預(yù)測結(jié)果D)；

　　(3)家系3：復(fù)合雜合子突變，包括錯義突變C.1155G>C(p.Trp385Cys)(SIFT及MutTa預(yù)測結(jié)果D)和剪接突變c.330+1G>A(SIFT及MutTa預(yù)測結(jié)果NA)。

　　3.新突變影響了CDC20的正常功能：

　　(1)剪接突變c.330+1G>A的影響：瓊脂糖凝膠電泳顯示，與野生型相比，c.330+1G>A具有不同大小的條帶，較大的條帶表示該突變導(dǎo)致的異常選擇性剪接亞型。該亞型的cDNA序列分析顯示c.330+1G>A剪接突變引起常規(guī)剪接位點缺失，導(dǎo)致內(nèi)含子2的保留和CDC20蛋白的提前終止。

　　(2)錯義突變

　　p.Arg296Gln,p.Arg322Gln,p.Trp385Cys和無義突變p.Arg322?的影響：通過檢測CHO細胞中CDC20蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)與野生型CDC20相比，錯義突變p.Arg296Gln和p.Trp385Cys導(dǎo)致CDC20蛋白水平降低，而無義突變p.Arg322?導(dǎo)致蛋白截短。錯義突變p.Arg322Gln對CHO細胞中CDC20蛋白水平無明顯影響，但既往有報道稱該突變導(dǎo)致患者體內(nèi)淋巴母細胞系中CDC20蛋白水平降低。

　　(3)CDC20突變對細胞周期的影響：野生型CDC20的過表達顯著降低了細胞周期蛋白B1(cyclinB1)的內(nèi)源蛋白水平，而大多數(shù)突變體影響cyclinB1的降解。

　　(4)CDC20突變對人類CDC20定位的影響：通過動物實驗發(fā)現(xiàn)p.Arg296Gln和p.Trp385Cys錯義突變的CDC20也表現(xiàn)出與野生型相似的正常著絲粒定位。相比之下，p.Arg322?無義突變的CDC20未能定位于著絲粒，表明CDC20蛋白的功能受損。

　　4.CDC20的突變影響Cdc20敲除小鼠*母細胞的表型拯救：前期有研究顯示小鼠*母細胞MI阻滯表型(注射Cdc20siRNA構(gòu)建)，通過注射人類野生型CDC20cRNA，MI阻滯表型可以被拯救，排出第一極體。與野生型CDC20相比，所有個體突變體都顯著降低了CDC20挽救第一極體排出的能力。以上結(jié)果表明，所有已鑒定的突變都影響了CDC20的正常功能

　　1.本研究發(fā)現(xiàn)了4個CDC20的新突變c.887G>A(p.Arg296Gln),c.964C>T(p.Arg322?),c.1155G>C(p.Trp385Cys)及c.330+1G>A(p.Glu111Ilefs?36),這些突變大多導(dǎo)致CDC20蛋白水平下降，并影響CHO細胞中cyclinB1的降解，剪接突變c.330+1G>a(p.Glu111Ilefs?36)引起蛋白轉(zhuǎn)錄異常。這項研究證實了CDC20在人類生殖中的關(guān)鍵作用。

　　2.不同的CDC20突變在不同的個體中導(dǎo)致不同的表型，包括*母細胞成熟阻滯、受精失敗和胚胎發(fā)育停滯等問題。

　　3.一些研究已經(jīng)報道了由同一基因的不同突變引起的表型不同，這種表型變異的確切機制需要在動物模型中進一步研究。

　　4.在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，cRNA注射可以挽救不孕癥患者的表型。然而，這種干預(yù)措施的安全性需要進行全面的評估，未來可能通過使用轉(zhuǎn)基因小鼠或靈長類動物進行進一步的探索。

　　5.由于全外顯子組測序的覆蓋范圍有限，本研究只能識別外顯子內(nèi)或附近的單核苷酸變化或小片段插入或缺失，而無法檢測到長片段插入和缺失、拷貝數(shù)變異和非翻譯區(qū)的突變。

　　本研究在CDC20中發(fā)現(xiàn)了三個新的導(dǎo)致女性不孕的雙等位基因突變，擴展了CDC20的突變譜，為女性不孕癥提供了遺傳診斷標記。

　　吳珊珊

　　鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖科在讀研究生

　　申春艷

　　醫(yī)學(xué)碩士，鄭大三附院生殖醫(yī)學(xué)科胚胎實驗室胚胎師。

　　畢業(yè)于北大醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系，研究方向為生殖調(diào)控。從事胚胎實驗室工作8年，具有豐富的胚胎實驗室相關(guān)知識，熟練掌握胚胎實驗室各項操作技能。

　　河南省醫(yī)學(xué)會低溫醫(yī)學(xué)分會第一屆青年委員會青年委員

　　主持河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)聯(lián)合共建項目1項

　　參與多項臨床科研及其他科研項目多項，發(fā)表中華及核心論文多篇