薛林濤王世凱毛獻(xiàn)寶李政達(dá)黃悅悅張小慧韋娉嬪陳良師譚衛(wèi)紅

　　廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，南寧530021

　　譚衛(wèi)紅，Email：ltxgxh 163.com，電話：+86-771-2186483

　　本文刊登于《中華生殖與避孕雜志》

　　2020,40(11):887-892.

　　目的建立一個(gè)能夠?qū)?胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）*子受精失敗進(jìn)行早期判斷進(jìn)而實(shí)施早期補(bǔ)救性人工激活的技術(shù)體系，并探討其激活效率及應(yīng)用價(jià)值。

　　方法首先回顧性分析2017年1月至2018年3月期間廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心150個(gè)采用時(shí)差胚胎動(dòng)態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)（Time-lapse）系統(tǒng)培養(yǎng)的ICSI周期第二極體（Pb2）釋放時(shí)間分布及其與受精及胚胎發(fā)育結(jié)局的關(guān)系，探討Pb2釋放作為ICSI受精失敗早期判斷指標(biāo)的可行性。其次采用隨機(jī)對照試驗(yàn)，收集2018年3月至2019年6月期間93個(gè)ICSI助孕周期的225個(gè)受精失敗*子，根據(jù)人工激活方式不同分為未激活組（NAOA組）、早期激活組（RAOA組）、晚期激活組（LAOA組），同時(shí)將其余ICSI注射*子作為對照組，比較4組受精及胚胎發(fā)育參數(shù)，探討ICSI受精失敗早期補(bǔ)救性人工激活的效率和應(yīng)用價(jià)值。

　　結(jié)果Time-lapse監(jiān)測ICSI注射后*子有Pb2釋放組的受精率（99.91%）、雙原核（2PN）受精率（97.76%）顯著高于無Pb2釋放組（0.03%、0.00%）且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.001）；ICSI注射后*子Pb2釋放時(shí)間為（3.04±1.45）h，Pb2釋放時(shí)間分布及占比分別為0~3 h（58.58%）、3~5 h（36.29%）、5~8 h（3.92%）、>8 h（1.21%）；NAOA組Pb2釋放率、受精率、2PN受精率均為0%，LAOA組2PN受精率（36.00%）、第3日（D3）優(yōu)質(zhì)胚胎率（8.00%）、第5日（D5）囊胚轉(zhuǎn)化率（0%）、D5優(yōu)質(zhì)囊胚轉(zhuǎn)化率（0%）均顯著低于RAOA組（60.00%、44.19%、51.16%、25.58%）且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，P=0.002，P<0.001，P=0.005），同時(shí)均顯著低于對照組（97.63%、48.62%、63.23%、37.94%）且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.001）；RAOA組Pb2釋放率（84.00%）、受精率（81.33%）、2PN受精率（60.00%）、2PN*裂率（95.56%）均顯著低于對照組（100.00%、99.68%、97.63%、99.51%）且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P<0.001，P<0.001，P=0.04），但D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、D5囊胚轉(zhuǎn)化率、D5優(yōu)質(zhì)囊胚轉(zhuǎn)化率2組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。

　　結(jié)論Time-lapse監(jiān)測Pb2釋放可以作為早期判斷ICSI*子受精失敗的指標(biāo)，在ICSI注射后5 h對受精失敗*子進(jìn)行早期補(bǔ)救性人工激活可以獲得正常受精和理想的胚胎發(fā)育結(jié)局。

　　【關(guān)鍵詞】延時(shí)成像；受精；極體；*胞質(zhì)內(nèi)單精子注射；人工激活

　　基金項(xiàng)目：廣西衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目（Z2015305）；南寧市青秀區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018025）

　　DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20191009-00442

　　*胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）通過人工注射精子進(jìn)入*胞質(zhì)內(nèi)的方式，很大程度上解決了由于精子質(zhì)量差或者受精障礙導(dǎo)致精子無法穿越透明帶的患者獲得精*結(jié)合的機(jī)會(huì)，但是目前臨床治療中仍然有將近20%的成熟*子注射精子后無法正常受精。已有研究證實(shí)，*子激活障礙是導(dǎo)致ICSI周期*子受精失敗發(fā)生的最主要原因［1］，而采用人工輔助激活方式能夠成功誘發(fā)*子Ca2+振蕩，啟動(dòng)第二次減數(shù)分裂進(jìn)而完成受精［2］，因此探討ICSI周期受精失敗*子的利用價(jià)值是提高單次取*周期*子利用率的有效途徑。本研究首先通過回顧性分析采用時(shí)差胚胎動(dòng)態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)（Time-lapse）培養(yǎng)的ICSI周期胚胎發(fā)育動(dòng)態(tài)參數(shù)，分析ICSI注射后第二極體（the second polar body，Pb2）釋放與受精及胚胎發(fā)育結(jié)局的關(guān)系，探討Pb2釋放作為早期受精失敗判斷指標(biāo)的價(jià)值和效率，進(jìn)而選取ICSI周期受精失敗的*子，采用隨機(jī)對照試驗(yàn)，分析不同人工激活方式對受精失敗*子激活效率以及胚胎發(fā)育結(jié)局的影響，探討建立一個(gè)ICSI受精失敗*子早期補(bǔ)救性人工激活（rescue artificial oocyte activation，RAOA）體系的可行性和應(yīng)用價(jià)值。

　　1.研究對象：回顧性分析2017年1月至2018年3月期間在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心進(jìn)行ICSI助孕治療患者的Time-lapse監(jiān)測分析數(shù)據(jù)。*子激活的隨機(jī)對照試驗(yàn)所用*子來源于2018年3月至2019年6月期間ICSI助孕周期患者剩余的受精失敗*子。本研究患者夫婦納入標(biāo)準(zhǔn)：①新鮮取*周期；②女方年齡≤38歲；③取*當(dāng)日用于ICSI注射成熟*子數(shù)≥3枚。本研究通過廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（KY-QXQ-2018-01）且患者均簽署科研知情同意書。

　　2.分組：根據(jù)Time-lapse監(jiān)測有無Pb2釋放分為有Pb2釋放組和無Pb2釋放組，比較2組受精參數(shù)，其次根據(jù)Time-lapse監(jiān)測Pb2釋放時(shí)間分為0~3 h組、3~5 h組、5~8 h組、>8 h組，比較4組受精及胚胎發(fā)育參數(shù)。*子激活隨機(jī)對照試驗(yàn)采用簡單隨機(jī)法進(jìn)行分組，根據(jù)人工激活方式不同分為未激活組（NAOA組）、早期激活組（RAOA組）、晚期激活組（LAOA組），其中NAOA組*子不進(jìn)行人工激活，直接移入培養(yǎng)液滴繼續(xù)培養(yǎng)，RAOA組在ICSI注射后5 h進(jìn)行人工激活后繼續(xù)培養(yǎng)，LAOA組在ICSI注射后20 h進(jìn)行人工激活后繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將其余ICSI注射*子作為對照組，比較4組受精及胚胎發(fā)育參數(shù)。

　　3.Time-lapse培養(yǎng)及Pb2監(jiān)測：ICSI注射后*子移入在Primo Vision dish（16606，丹麥Vitrolife公司）培養(yǎng)皿中37℃，6%CO2平衡過夜的胚胎培養(yǎng)液中，放入Primo Vision（Primo Vision Evo，匈牙利Vitrolife公司）時(shí)差監(jiān)測系統(tǒng)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃，6%CO2，5%O2。培養(yǎng)箱內(nèi)安裝好Primo Vision時(shí)差系統(tǒng)并連接Analyzer圖像分析軟件，設(shè)置拍攝間隔頻率為10 min，7個(gè)等距的焦平面掃描間隔頻率為60 min。采用Time-lapse監(jiān)測Pb2釋放情況及胚胎發(fā)育進(jìn)程，其中明確觀察到極體自胞質(zhì)內(nèi)釋放定義為Pb2釋放，所有動(dòng)態(tài)發(fā)育參數(shù)時(shí)間點(diǎn)判定由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)技術(shù)人員雙人核對確認(rèn)。

　　4.*子人工激活處理：將受精失敗*子移入預(yù)先配制的含10μmol/L離子霉素的50μL受精液（G-IVFplus，瑞典Vitrolife公司）微滴中，每個(gè)微滴放入1個(gè)*子，在37℃、6%CO2、5%O2的培養(yǎng)箱中激活處理10 min，然后在胚胎培養(yǎng)液（G-1plus，瑞典Vitrolife公司）微滴中充分清洗轉(zhuǎn)移放入Primo Vision dish中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　5.受精及胚胎培養(yǎng)：采用Time-lapse監(jiān)測受精及胚胎發(fā)育進(jìn)程，ICSI注射或*子激活后第1日對受精情況進(jìn)行評價(jià)，胞質(zhì)中觀察到原核定義為受精，觀察到2個(gè)原核定義為正常受精；第3日根據(jù)分裂速度、*裂球的均勻性和碎片比例等對*裂期胚胎進(jìn)行質(zhì)量評分，其中第3日來源于正常受精*的7~9-細(xì)胞且碎片比例<10%的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎；第5日參考Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)對囊胚進(jìn)行質(zhì)量評分，根據(jù)囊胚腔大小和孵出程度分為6期，其中3期以上囊胚根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目分為A、B、C 3個(gè)等級(jí)，3期及3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評分不含C的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　1.患者一般資料：共收集150個(gè)ICSI助孕周期的Time-lapse監(jiān)測數(shù)據(jù)，女方年齡為（32.06±4.85）歲，男方年齡為（35.37±6.11）歲，共獲*1748個(gè)，其中ICSI注射1453個(gè)，總受精率為73.78%（1072/1453），2PN受精率為72.13%（1048/1453）。受精失敗*子共收集到225個(gè)，來源于93個(gè)ICSI助孕周期，女方年齡為（32.25±4.61）歲，男方年齡為（36.12±6.49）歲，共獲*1070個(gè)，其中ICSI注射867個(gè)，總受精率為72.78%（631/867），2PN受精率為71.28%（618/867）。

　　2.Pb2釋放與ICSI受精結(jié)局的關(guān)系：Time-lapse監(jiān)測ICSI注射后*子有Pb2釋放組的受精率和2PN受精率分別為99.91%和97.76%，均高于無Pb2釋放組（0.03%、0%），組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

　　3.Pb2釋放時(shí)間分布及占比：Time-lapse監(jiān)測ICSI注射后*子Pb2釋放時(shí)間為（3.04±1.45）h，Pb2釋放時(shí)間分布及占比分別為0~3 h（58.58%）、3~5 h（36.29%）、5~8 h（3.92%）、>8 h（1.21%）。

　　4.Pb2釋放時(shí)間與受精及胚胎發(fā)育結(jié)局的關(guān)系：不同Pb2釋放時(shí)間分組受精率、2PN受精率、第3日（D3）優(yōu)質(zhì)胚胎率組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；5~8 h組和>8 h組2PN*裂率均低于0~3 h組和3~5 h組，但僅5~8 h組與0~3 h組、3~5 h組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，P=0.003）；>8 h組D5囊胚轉(zhuǎn)化率低于0~3 h組、3~5 h組、5~8 h組且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P=0.003，P=0.024）；0~3 h組D5優(yōu)質(zhì)囊胚轉(zhuǎn)化率高于3~5 h組、>8 h組且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008，P=0.049）（表1）。

　　5.不同人工激活方式對受精及胚胎發(fā)育結(jié)局的影響：NAOA組Pb2釋放率、受精率、2PN受精率均為0%，與其他3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；LAOA組受精率低于RAOA組和對照組，但僅與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），LAOA組2PN受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、第5日（D5）囊胚轉(zhuǎn)化率、D5優(yōu)質(zhì)囊胚轉(zhuǎn)化率均顯著低于RAOA組且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，P=0.002，P<0.001，P=0.005），同時(shí)均顯著低于對照組且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；RAOA組僅Pb2釋放率、受精率、2PN受精率、2PN*裂率顯著低于對照組且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P<0.001，P<0.001，P=0.04），D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、D5囊胚轉(zhuǎn)化率、D5優(yōu)質(zhì)囊胚轉(zhuǎn)化率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

　　精子穿越透明帶與*膜融合進(jìn)入*胞質(zhì)內(nèi)以及精子誘發(fā)*子Ca2+振蕩是正常受精發(fā)生的生理基礎(chǔ)［3］。ICSI技術(shù)借助顯微操作將精子直接注射進(jìn)入*胞質(zhì)，解決了由于嚴(yán)重男方因素或精*結(jié)合障礙所致精子無法穿越透明帶患者獲得精*結(jié)合的機(jī)會(huì)，但這并不能保證正常受精發(fā)生。據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)輔助生殖技術(shù)數(shù)據(jù)上報(bào)系統(tǒng)顯示2016年我國ICSI周期2PN受精率為76.45%［4］，仍然有20%左右的成熟*子完成精子注射后無法受精，同時(shí)臨床資料顯示1%~5%的ICSI周期發(fā)生完全受精失?。?］。研究證實(shí)*子激活障礙是導(dǎo)致ICSI周期受精失敗發(fā)生的最主要因素，而采用人工輔助激活方式能夠成功誘發(fā)*子Ca2+振蕩重啟受精進(jìn)程。因此探討ICSI受精失敗RAOA的效率和應(yīng)用價(jià)值是一個(gè)提高*子利用率的有效途徑。

　　受精失敗的準(zhǔn)確判斷是對ICSI受精失敗*子實(shí)施人工輔助激活的前提和基礎(chǔ)，正常受精發(fā)生進(jìn)程中Pb2釋放和雌雄原核形成是必經(jīng)的兩個(gè)標(biāo)志性生理事件，也是受精判斷的兩個(gè)關(guān)鍵形態(tài)學(xué)標(biāo)志。目前臨床常規(guī)以受精后16~18 h觀察原核形成作為受精成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)，但是由于*子體外培養(yǎng)時(shí)間過長，在此階段實(shí)施補(bǔ)救受精效果并不理想，因此相較而言Pb2釋放是一個(gè)更有價(jià)值的早期預(yù)測受精的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，并且已在IVF受精失敗周期補(bǔ)救ICSI（RICSI）中得到證實(shí)和應(yīng)用［6］。但值得注意的是RICSI技術(shù)中Pb2判斷多以固定時(shí)間點(diǎn)倒置顯微鏡下觀察方式進(jìn)行，而Pb2釋放是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，且有一定比例*子Pb2存在部分碎裂或者與Pb1緊密排列等形態(tài)特征，容易導(dǎo)致誤判，因此傳統(tǒng)Pb2觀察方式不是最佳的準(zhǔn)確早期判斷受精失敗的指標(biāo)。Time-lapse技術(shù)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測體外胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育全程，在觀察分析受精及胚胎發(fā)育進(jìn)程中的形態(tài)學(xué)生理事件方面具有獨(dú)特優(yōu)勢［7］。本研究顯示利用Time-lapse技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)追蹤極體自*胞質(zhì)中釋放至*周隙的動(dòng)態(tài)生理過程，克服了靜態(tài)圖像觀察的缺點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確判斷Pb2釋放，研究結(jié)果也顯示Time-lapse觀察ICSI后有Pb2釋放的*子受精率達(dá)到99.91%，而無Pb2釋放的*子受精率僅為0.03%，且2PN受精率為0%。這也證實(shí)Pb2釋放是正常受精必經(jīng)的生理進(jìn)程，Time-lapse監(jiān)測Pb2釋放可以作為早期判斷受精失敗的指標(biāo)。

　　早期受精失敗判斷后何時(shí)實(shí)施人工輔助激活直接影響激活效率。自然生理狀態(tài)下精*融合數(shù)分鐘后細(xì)胞內(nèi)Ca2+振蕩即已啟動(dòng)，但若精子或*子功能障礙無法觸發(fā)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+釋放，則會(huì)導(dǎo)致受精失敗。臨床研究表明在精子顯微注射后采用Ca2+載體人工激活*子誘發(fā)內(nèi)源Ca2+振蕩也可重啟第二次減數(shù)分裂完成受精，并在圓頭精子癥等精子激活功能障礙的病例中有較多應(yīng)用，且已有活產(chǎn)嬰兒出生［8-9］。同時(shí)在一些研究中顯示，ICSI后18~72 h的*子仍然可以被外源Ca2+載體激活并有正常受精*形成，但由于*子老化胚胎發(fā)育結(jié)局較差［10-11］，因此在準(zhǔn)確判斷受精失敗的基礎(chǔ)上盡早進(jìn)行人工輔助激活有助于對ICSI受精失敗*子進(jìn)行早期補(bǔ)救。本研究結(jié)果顯示ICSI周期Pb2釋放時(shí)間為（3.04±1.45）h，這與Liu等［12］的研究結(jié)果一致，其中94.87%的*子在精子注射后5 h內(nèi)釋放Pb2，且Pb2釋放時(shí)間與后繼的受精及胚胎發(fā)育結(jié)局存在相關(guān)性，因此本研究選擇ICSI后5 h作為實(shí)施早期補(bǔ)救性人工激活的時(shí)間點(diǎn)，研究結(jié)果顯示5 h RAOA組和20 h LAOA組*子激活率均顯著高于NAOA組，這也證實(shí)對ICSI受精失敗*子實(shí)施人工輔助激活可以激活*子，同時(shí)結(jié)果顯示20 h晚期激活組雖然*子有Pb2釋放，但多為異常受精，2PN受精率僅為36%，顯著低于5 h RAOA組，在胚胎發(fā)育參數(shù)上也顯示出同樣趨勢，20 h LAOA組胚胎發(fā)育尤其是囊胚形成結(jié)局極差，這說明在早期階段對ICSI受精失敗*子進(jìn)行補(bǔ)救激活是保證正常受精及胚胎發(fā)育潛能的關(guān)鍵。另外本研究顯示，早期補(bǔ)救激活雖然能獲得60%的正常受精率，但與ICSI后Pb2正常釋放的*子相比存在顯著差異，且胚胎發(fā)育參數(shù)也均有所降低，這也提示ICSI周期中受精失敗的發(fā)生大多與精子或*子功能障礙相關(guān)，而配子功能障礙也多與核DNA損傷、基因組異常等并發(fā)。雖然本研究結(jié)果顯示早期補(bǔ)救性人工激活可以獲得形態(tài)學(xué)評估正常的體外胚胎，但對其染色體狀態(tài)及甲基化修飾等分子層面的安全性評估，值得進(jìn)一步深入探討。

　　另外本研究建立的ICSI受精失敗*子早期補(bǔ)救性激活技術(shù)體系不僅在提高ICSI周期*子利用率上具有應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也有助于*子人工激活技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)一步合理化。目前*子體外人工激活多應(yīng)用在圓頭精子癥或ICSI反復(fù)受精異?；颊咧?，但其存在兩個(gè)問題，一是即使是圓頭精子ICSI后仍有部分*子可以正常受精，如果按照目前臨床常規(guī)將所有ICSI*子整體人工激活，存在正常受精*子非生理性人工激活干涉的風(fēng)險(xiǎn)，二是反復(fù)ICSI受精異常周期需要2~3個(gè)失敗周期驗(yàn)證，而不能對當(dāng)周期受精失敗*子及時(shí)補(bǔ)救，是對珍貴*子資源的浪費(fèi)，也增加患者治療負(fù)擔(dān)，因此如果采用RAOA技術(shù)不僅可以對受精情況進(jìn)行預(yù)判，篩選出ICSI后具備自然受精能力*子，同時(shí)也可及時(shí)補(bǔ)救受精失敗*子，本研究為*子人工激活技術(shù)的臨床應(yīng)用提供一個(gè)新策略。

　　綜上所述，Time-lapse監(jiān)測Pb2釋放是一個(gè)準(zhǔn)確的早期判斷ICSI受精失敗的指標(biāo)，在ICSI后5 h對受精失敗*子實(shí)施RAOA能夠獲得正常受精和理想的胚胎發(fā)育結(jié)局，是一個(gè)提高*子利用率的有效途徑，同時(shí)對早期補(bǔ)救性激活技術(shù)的安全性評估是下一步研究的重點(diǎn)，有助于指導(dǎo)該技術(shù)的臨床合理應(yīng)用。